BioXplorer

Соединение фрагментов с вектором

Предлагаемый метод пригоден для лигирования частичных гидролизатов Sau3Al в вектор Lorist2.

1. Добавьте вместе 1 мкл BamHI-обработанного де-фосфорилированного Lorist2; 2 мкл приготовленных 5аиЗА1-фрагментов; 2 мкл 10 X лигазного буферного раствора; 2 мкл 10 мМ АТР, рН 7,4; 2 мкл 0,1 М дитиотрей-тола; 10 мкл воды и 1 мкл лигазы. Для достижения максимально возможного лигирования поместите смесь в закрытый капилляр.

2. Инкубируйте 16 ч при 14°С.

3. Осторожно упакуйте, руководствуясь соответствующей методикой.

4. Храните библиотеку при 4°С под хлороформом.

5. Разведите 5 мкл упакованной библиотеки в 0,1 мл раствора для разведения.

Добавьте 0,2 мл стационарной культуры клеток. Мы используем для этих целей линию 1046. Ее следует регулярно пересевать через отдельные колонии, контролируя признак reck.

Инкубируйте 20 мин при 37°С. Добавьте 0,5 мл раствора CY и проинкубируйте дополнительно 50 мин. Высейте разные объемы на чашки с канамицином. Ожидаемый выход – 105–106 рекомбинантов на 1 мкг вставочной ДНК.

Другие статьи:

Первые шаги климатологии.
Путешественники и мореплаватели древности уже весьма давно обратили внимание на различие климатов тех или других стран, которые им довелось посетить. Климатология, таким образом, в течение веков шла рука об руку с географией, будучи ее не ...

Потенциал покоя, уравнение Нернста
Между внутренней и наружной поверхностями клеточной мембраны всегда существует разность электрических потенциалов. Эта разность потенциалов, измеренная в состоянии физиологического покоя клетки, называется потенциалом покоя. Причиной воз ...

Теоретическая часть. История изготовления пива
С древнейших времен люди занимались изготовлением ароматного слабоалкогольного пенистого напитка, с хмелевой горечью, больше известного нам под названием ПИВО. Историки считают, что еще за 7 тысяч лет до н.э. в Вавилоне варили пиво из яч ...